Quantitative Study of Membrane Nano-organization by Single Nanoparticle Imaging
Etude quantitative de la Nano-organisation Membranaire par Imagerie Simple de Nanoparticules
Résumé
In this thesis, EGF, CPεT and transferrin receptors were labeled with luminescent nanoparticles, , and were tracked both in their local environment in the cell membrane and under a hydrodynamic flow. Bayesian inference, Bayesian decision tree, and data clustering techniques can then be applied to obtain quantitative information on the receptor motion parameters. Furthermore, we introduced hydrodynamic force application in vitro to study biomolecule dissociation between membrane receptors and their pharmaceutical ligands in high affinity receptor- ligand pairs, such as HB-EGF and DTR. Finally, three different modes of membrane organization and receptor confinement were revealed: the confinement of CPεTR is determined by the interaction between the receptors and the lipid/protein constituents of the raft; the confining potential of EGFR results from the interaction with lipids and proteins of the raft environment and from the interaction with F-actin; transferrin receptors diffuse freely in the membrane, only sterically limited by actin barriers, according to the “picket-and-fence” model. We moreover showed that all raft nanodomains are attached to the actin cytoskeleton.
La nano-organisation de la membrane cellulaire est essentielle à la régulation de certaines fonctions cellulaires. Dans cette thèse, les récepteurs EGF, CPεT et de la transferrine ont été marqués avec des nanoparticules luminescentes et ont été suivis à la fois dans leur environnement local dans la membrane cellulaire vivantes pour de longues durées et sous un flux hydrodynamique. Nous avons alors appliqué des techniques d'inférence bayésienne, d’arbre de décision et de clustering de données extraire des informations quantitatives sur les paramètres caractéristiques du mouvement des récepteurs, notamment la forme de leur confinement dans des microdomaines. L’application d’une force hydrodynamique sur les nanoparticules nous a alors permis de sonder les interactions auxquelles ces récepteurs sont soumis. Nous avons appliqué cette approche in vitro pour favoriser et mesurer la dissociation in vitro de paires récepteur / ligand à haute affinité entre des récepteurs membranaires et leurs ligands pharmaceutiques, telles que HB-EGF et DTR et l’avons ensuite appliqué à l’étude d’interactions à la membrane cellulaire. Nous avons ainsi mis en évidence trois modes différents d'organisation de la membrane et de confinement des récepteurs: le confinement de CPεTR est déterminé par l'interaction entre les récepteurs et les constituants lipidiques / protéiques des microdomaines, le potentiel de confinement de l'EGFR résulte de l'interaction avec les lipides et les protéines de l’environnement du radeau et de l’interaction avec la F-actine; les récepteurs de la transferrine diffusent librement dans la membrane, uniquement limités stériquement par des barrières d’actine, selon le modèle ‘picket-and-fence’. Nous avons de plus montré que les nanodomaines de type radeau sont rattachés au cytoskelette d’actine. Ce travail présente donc à la fois un aperçu quantitatif du récepteur membranaire, des mécanismes d’organisation à l’échelle nanométrique, et établit un cadre méthodologique avec lequel différents types de propriétés membranaires peuvent être étudiés.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
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